Clostridium Difficile

CLOSTRIDIUM DIFFICILE : UNE BACTERIE D'ACTUALITE

Clostridium difficile est responsable d'inflammations intestinales surtout chez les malades hospitalisés pendant une longue durée.
Clostridium difficile est le principal agent responsable de diarrhées post-antibiotiques et il est souvent impliqué dans les diarrhées nosocomiales surtout celles de l’adulte.

Table des matières

L'AUTEUR

Salim Djelouat

Professor Medical Analyses and Medical bacteriology / Scientific Author / knolAuteur

CLOSTRIDIUM DIFFICILE :

ÉTUDE BACTÉRIOLOGIQUE ET DIAGNOSTIC

Par : Salim Djelouat

Synonyme : Bacillus difficilis

Abréviation : C. difficile

01 – Objectifs

Ce document a pour but de répondre à des interrogations par la présentation de cette bactérie « opportuniste », mais responsables d’épidémies de diarrhées, très souvent mortelles.

02 – Argumentation

De très nombreuses épidémies de diarrhées associées à Clostridium difficiles ont été récemment décrites et leurs prises en charge très mal faites.

03 – Introduction

Clostridium difficile est la bactérie la plus fréquemment retrouvée dans les diarrhées associées aux traitements par antibiotiques et pendant de longues périodes.

L’administration d’antibiotiques surtout à large spectre entraine des changements dans la flore intestinales ce qui va favoriser la colonisation de ce dernier par Clostridium Difficile.

Clostridium difficile est un bacille à Gram (+), anaérobie strict et sporulé.

C’est un entéropathogène responsables d’inflammations intestinales chez les malades hospitalisés en longue durée.

Clostridium difficile est le principal agent responsable de diarrhées post-antibiotiques et il est souvent impliqué dans les diarrhées nosocomiales surtout celles de l’adulte.

04 – Historique

   La colite pseudomembraneuse (C.P.M), fut décrite pour la première fois par Finney en 1893 au cours d’une chirurgie digestive.
   Et fut redécrite une deuxième fois vers les années 1974.
   En 1935, Hall et O’Toole décrivent la bactérie dans les selles de nouveaux nés et lui donnèrent le nom de bacillus difficile (qui vient du Latin difficilis), en raison des difficultés qu’ils éprouvèrent à la cultiver et à l’isoler.
   En 1940, Snyder isola Clostridium difficile chez des nourrissons âgés de 10 semaines à 1 an.
   En 1960, Mc Bee, isola clostridium difficile d’un contenu intestinal.
   En 1962, Smith et king, signalèrent sa présence dans les infections humaines.
   L'introduction de la clindamycine (famille des lincosamides) en thérapeutique entraîne une flambée d'observations de C.P.M et ce suite à une perturbation de la flore intestinale qui va permettre aux souches toxinogènes de se multiplier et de produire leurs toxines.
   Ceux sont Larson (Angleterre) et John Bartlett (USA) qui démontrent l'existence d'une activité cytotoxique dans les selles de patients atteints de C.P.M post-antibiotiques.

Enfin en 1984 sont caractérisées :

1 - la toxine A (entérotoxine)
2 - la toxine B (cytotoxine)

05 – Habitat

a– Chez l'adulte :

Portage digestif et asymptomatique est estimé actuellement vers les 5 à 7% de la population adulte.

En cas de traitement antibiotiques prolongé ou lors d’un séjour dans une unité de soins, le portage peut atteindre 20 à 25% des sujets.

b – Chez les enfants de moins de 2 ans :
Le taux de portage reste très élevé et peut atteindre 50 à 70% des cas.

c – Après 2 ans :
La fréquence de Clostridium difficile est presque comparable à celle de l’adulte.

d – Dans la nature:
Clostridium difficile est retrouvé dans le milieu extérieur : sol, l’eau (de rivières, lacs, eau de mer, eaux de piscine…).

Il est aussi rencontré dans presque tous les végétaux crus

On le trouve aussi dans les milieux hospitaliers, les crèches et les foyers pour les personnes âgées.

e – Chez les animaux :
C. difficile est rencontrés chez les bovins, ovins, porcs, volaille, les oiseaux….

06 – Étude épidémiologique

    Cet agent est majoritairement impliqué dans les diarrhées nosocomiales de l'adulte.
   Plusieurs dizaines d'épidémies ont été décrites aux USA et en Europe, d’où une surveillance en milieu hospitalier.
   Un clone particulier appelé P.C.R ribotype 027 de cette bactérie, a été identifié et associé à une morbidité et une mortalité très élevées.
   Cette bactérie est extrêmement contagieuse, en raison de la rémanence de spores sur les surfaces   inertes ; elle nécessite des mesures drastiques d’isolement des patients, d’hygiène et de désinfection.
   A noter, que les personnes en bonne santé ne sont pas affectées par C. difficile.
   C. difficile est une bactérie assez résistante aux antibiotiques.

Les principaux facteurs de risques sont :

Forte contamination de l’environnement

Promiscuité des patients

Fréquence des soins

Mauvaise sélection des antibiotiques et longues durées de prescription

Age avancé et supérieur à 65 ans

Modification de l’écosystème digestif

07 - Les principaux mécanismes de transmission

a – En milieu extra-hospitalier :

La bactérie est présente dans les selles d’où une transmission féco-orale.

La résistance de la spore de Clostridium difficile, va lui permettre de persister longtemps dans le milieu extérieur et à l’acidité gastrique.

L’antibiothérapie, un âge avancé l’état du patient, sont des facteurs influants l’infection.

b – En milieu hospitalier :

La transmission se fait par contact avec des surfaces contaminées par les selles ou par certains objets de l’environnement tels que par exemple : chasse d'eau, robinets, poignées de porte…

La contamination interhumaine (le personnel et les visiteurs), se fait par des mains contaminées.

08 - Physiopathologie

La prescription depuis plusieurs jours d'antibiotiques à large spectre (aminopénicillines, céphalosporines) ou à spectre étroit (clindamycine), entraîne au sein de la flore digestive, l'émergence et la sélection de Clostridium difficile qui va produire des toxines et des enzymes.
Clostridium difficile possède de nombreux facteurs de pathogénicité

a – En milieu extra-hospitalier :

Il existe trois principaux facteurs de virulence de C. difficile :

a1 - La toxine A est nommée entérotoxine :

   Car elle fortement entérotoxique dans le modèle de l’anse ligaturée de lapin ; elle possède également une activité cytotoxique.
   Elle induit une inflammation importante, avec une infiltration massive des polynucléaires et des cellules mononuclées.
   Cette inflammation se complique en nécrose de l’épithélium intestinal avec une accumulation de fluide.

a2 - La toxine B ou cytotoxine :

   Elle est mille fois plus puissante que la toxine A et s’attaque directement aux cellules de l’épithélium.
   Elle induit un effet cytopathogène avec augmentation de la perméabilité de la muqueuse intestinale.
   Ces deux toxines agissent en synergie.
   Les souches non toxinogènes sont considérées comme non virulentes.

a3 – la toxine ADP-ribosyltransfèrase :

Elle est produite par certaines souches, cette toxine participe au pouvoir pathogène par dépolymérisation de l’actine.

b – Autres facteurs de virulence :

b1 - enzymes protéolytiques (hyaluronidase, gélatinase, collagénase…), :ces enzymes facilitent le maintien des bactéries dans le tube digestif.
b2 - Mobilité :par des flagelles
b3 - adhésion par pili fimbriae (leur nature à ce jour n’est pas connue avec certitude).
b4 - capsule (présence de polysaccharides de surface), joue un rôle dans la résistance à la phagocytose.

09 - Pouvoir Pathogène Naturel (PPN)

C. difficile e st responsable de 15 à 25% des diarrhées post – antibiotiques et de colites pseudomembraneuses.

La colite pseudomembraneuse est la forme la plus sévère de la maladie.

Plus de 95% des C.P.M présentent les signes suivants :

diarrhées aqueuses

fièvre

déshydratation

perte de l’appétit

douleurs et crampes abdominales nausées

les selles sont rarement hémorragiques

Important :

À l’examen cytologique des selles : on note une hyperleucocytose

Les complications sont graves:

perforation

péritonite

mégacôlon toxique pouvant entrainer le décès du malade (dans Presque les 40% des cas)

   Les signes cliniques régressent dans 25% des cas après l’arrêt de l’antibiotique responsable.
   Les rechutes sont fréquentes (20%) et surviennent dans les 2 mois suivant l’épisode.
   Chez les nouveau-nés et chez les jeunes enfants nourris au lait maternel, les infections à C. difficile sont très rares et ce malgré une très forte concentration en toxines dans leurs selles : Voir : Le lait maternel : un nouveau regard

Colite pseudomembraneuse

10 - Étude Bactériologique

a – Caractères morphologiques :

Clostridium difficile est un bacille à extrémité légèrement renflée et à Gram positif, mesurant 0,7 à 2 µm de diamètre et ayant une longueur de 3 à 16µm de longueur.

   Il peut se présenter soit groupés ou en courtes chainettes (4, 6 ou 8 cellules).

                          Courtesy CDC

   Mobilité (+) par ciliature péritriche
   Capsule (+) (S-layer)
   Spore (+), subterminales, rarement terminales est à coloration Gram négatif.

b – Caractères culturaux :

Clostridium difficile est un germe anaérobie strict

La température optimale de croissance est de 37°C, mais accepte des variations de températures de 25 et à 45 °C.

b1 - Sur gélose au sang -

   Après 24 heures d'incubation :
       Les colonies sont circulaires ou à contour irrégulier, elles sont plates ou légèrement convexes, opaques, blanchâtres ou grisâtres et leur diamètre est compris entre 2 et 5 mm.
   A noter qu’il y a une absence d’hémolyses

   Après 48 heures d'incubation :
   Les colonies présentent une fluorescence vert pâle.

b2 - En bouillon PYG,

La croissance se traduit par un trouble,

En 5 jours, il y a apparition d’un sédiment et d’une acidification du milieu (pH 5 à 5,5)

c – Caractères biochimiques :

Catalase (-)

Glucose (+)

Mannitol (+)

Gélatinase (+)

Esculine (+)

Lactose (-)

Saccharose (-)

Inuline (-)

Nitrate réductase (-)

Indole (-)

Mannitol (V)

11 - Démarche du diagnostic

a – La recherche de Clostridium Difficile se fait chez :

Patients diarrhéiques
Patienst sous antibiothérapie < 4 semaines, (la durée de l' antibiothérapie majore le risque) ou hospitalisation récente
Patients sous chimiothérapie
Prise de laxatifs ou de stimulants gastro-intestinaux
Tous les facteurs modifiant l'écosystème ou la motilité intestinale

b – La démarche du diagnostic :

Repose en priorité sur la recherche des toxines, parallèlement à la culture de Clostridium difficile.
Le diagnostic bactériologique est un examen inhabituel qui est demandé dans un contexte clinique particulier.

       b1 – Prélèvement :

   C. difficile est recherché à partir des selles liquides en évitant l’écouvillonnage rectal.
   La recherche des toxines doit être effectuée à partir de selles liquides ou de liquides intestinaux (examen endoscopique).
   Si l’examen est différé, les échantillons doivent être conservés à 4° C.
   La conservation à température ambiante ou la congélation à - 80°C diminuent notablement l’activité des cytotoxines.
   La quantité de selles à prélever est de 3 ml minimum à 5 ml.

   A noter que Clostridium difficile peut être aussi isolé lors de certaines :

bactériémies
péritonites
d'abcès intra-abdominaux
d'infections de plaies chirurgicales
d'abcès du cerveau
d'ostéomyélites...

b2 – Mise en évidence des toxines :

   La grande majorité des souches produisent simultanément les toxines A et B.
   Leur mise en évidence directement à partir des selles est un excellent marqueur de la présence d’une souche toxinogène de C. difficile.
    Il existe plusieurs techniques de recherches, les principales sont :

b2a - La méthode par la recherche de l'effet cytopathogéne (ECP) de la toxine B par culture cellulaire (méthode de référence) :

Différentes lignées cellulaires sont utilisables : MRC5, Véro, CHO, HeP2.

Cette méthode présente une excellente sensibilité (ordre du pico gramme) mais se heurte à l’absence de standardisation et nécessite une infrastructure lourde, le délai de réponse est de plusieurs jours.

Il existe actuellement un test automatisé de détection des toxines A et B de clostridium difficile, lancé en juillet 2007 par les laboratoires BioMérieux et baptisé VIDAS® C. difficile Toxin A&B,

Ce test, utilise une nouvelle solution assez rapide et performante.

Ces principaux avantages sont :

Rapidité dans les résultats : en 75 minutes seulement (contre 24 à 48 heures pour la méthode de référence).
Prise des décisions thérapeutiques et d’isolement des patients plus rapides

b2b - Tests immuno-enzymatiques, surtout tests ELISA ou tests unitaires, immuno-enzymatiques ou immuno-chromatographiques :
Ils détectent soit la toxine A seule, soit les toxines A et B au moyen d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux.

   Les tests unitaires rapides permettent de rendre un résultat en moins de 30 minutes.
   La spécificité des méthodes ELISA est bonne (>95%) avec une sensibilité qui varie selon les études (60-90%).
   Ils existent cependant de faux négatifs

b2c - Techniques de biologie moléculaire ou P.C.R ;

Servent pour détecter les toxines A et/ou B est encore d’application limitée à cause de l'extraction des selles et de l'éventuelle présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase.
De nouveaux kits d’extraction et le développement de la P.C.R en temps réel devraient rendre ces nouvelles approches intéressantes dans un avenir proche.

c – La culture et la mise en évidence de la bactérie dans les selles :

      Ils existe plusieurs techniques :

       c1 - Diagnostic rapide par recherche d’antigène dans les selles
   Il s’agit du glutamate déshydrogénase qui peut être mise en évidence par agglutination (test latex) ou par méthode immuno-enzymatique, (Le test "Triage® C. difficile Panel" (Biosite Diagnositcs Inc.).
   La spécificité est bonne mais ces tests ne représentent que des méthodes de dépistage puisqu’ils ne préjugent pas du caractère toxinogène de la souche.

c2 - Isolement de Clostridium difficile par culture

L’examen microscopique des selles est peu informatif.
La culture est effectuée dans des conditions d'anaérobiose stricte (sachet individuel + jarre), sur milieux sélectifs comme le milieu TCCA :

gélose cœur cervelle aditionnée de 5% de sang de cheval
0,1% de taurocholate (sert comme substance enrichissante permettant la germiantion des spores, ce qui fait augmenter la sensibilité de la culture).
250 mg/l de cyclosérine (inhibiteur)
10 mg/l de céfoxitine (inhibiteur)

Les subcultures peuvent être effectuées sur gélose au sang ou milieu de Wilkins-Chalgren.
Après 48 h d'incubation en anaérobiose à 37°C, les colonies sont faciles à repérer, elles présentent les caractéristiques suivantes :

colonies circulaires à bords irréguliers (3 - 5 mm), non hémolytiques
colonies présentant un aspect de verre fritté à la loupe binoculaire
odeur caractéristique de crottin de cheval (libération de crésol)
colonies fluorescentes sous UV (mais dépend du milieu utilisé)

Autres milieux de culture spécifiques pour clostridium difficile : :

1 - milieu sélectifs prêts à l’emploi :

milieu CCFA (cycloserine-cefoxitin-fructose agar)
Gélose Clostridium difficile : (BioMérieux)
Clostridium Difficile Selective Agar (CDSA) :

2 - Milieux non sélectifs prêts à l'emploi :

Gélose Schaedler + 5% de sang de mouton (BioMérieux)
Gélose Columbia + 5% sang de mouton (BioMérieux)

3 - Milieux en poudre :

Base Columbia (BioMérieux), ajouté 5% de solution de jaune d'œuf (Becton-Dickinson)
Milieu pour Clostridium difficile + suppléments (Oxoid)

4 - Milieux de transport :

Gélose profonde (type VF)
boite au sang sous sachet de type Anaerogen Compact (Oxoid), Anaerocult P (Merck)

Quel que soit le milieu utilisé, il est recommandé d'ajouter de la cyclosérine à raison de 200 µg /mL.
Incuber en anaérobiose 24 à 48h.

c3 – L’identification

Elle peut être réalisée par utilisation de galeries biochimiques rapid ID 32A, API 20A ..., mais la plupart des caractères de cette bactérie sont négatifs.
Elle se fait aussi par le typage des souches et par des méthodes génotypiques : :

PCR-ribotypage
Toxinotypie
Marqueurs de différenciation des souches isolées

   d - Diagnostic radiologique par endoscopie :
   Associée ou non à la tomographie axiale.
   Il permettra de visualiser certains aspects caractéristiques:

une infiltration inflammatoire intense de la muqueuse du côlon et du rectum et
la présence de fausses membranes fibrineuses adhérentes à la muqueuse.

12 - Antibiogramme et Antibiothérapie

   L’antibiogramme ne présente qu'un intérêt taxonomique (résistance naturelle à certaines ß-lactamines dont la céfoxitine ou FOX).

       Habituellement sensible

Amoxicilline
Pipéracilline
Imipénème
Glycopeptides
Imidazolés
Erythromycine (plusieurs souches sont devenues résistantes)
Tétracycline
Rifampicine
Chloramphénicol

Résistance naturelle

Céphalosporines
Céfoxitine
Moxalactam
Fluoroquinolones

Résistance acquise

Clindamycine (CLI) est relativement fréquente.

13 - Stratégies thérapeutiques

    Le traitement est simple :

       1 - Arrêt de l’antibiothérapie si possible
       2 -Traitements spécifiques (voir tableau)
       3 - prévention des rechutes
       4 - Certaines études ont montré que l’association d’agents probiotiques (Saccharomyces boulardii ou Lactobacillus GG) aux traitements antibiotiques usuels, diminuerait le taux de récurrence.

Stratégies :

a - Le traitement antibiotiques : il est indiqué que dans les situations suivantes :

Diarrhée sévère ou signes de colite (ex. fièvre, leucocytose, signes de colite au scanner ou à l’endoscopie).
Persistance de la diarrhée malgré l’arrêt de l’antibiotique en cause.
Nécessité de poursuivre l’antibiotique responsable en raison de l’infection sous-jacente.

La vancomycine et le métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites

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vendredi 2 décembre 2011